TaqMan探针法

TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的5'-3’外切核酸酶活性，切断探针,产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合,所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和-条探针。探针只与模板特异性地结合,其结合位点在两条引物之间。探针的5端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等 ，3端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q) ,如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收,仪器检测不到信号。随着PCR的进行, Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针,其3'→5'外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团,其能量不能被吸收，即产生荧光信号(如下图)。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段样,有个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。

SYBR Green I染料法

SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是-种只与DNA双链结合的荧光染料(如下图) 。当它与DNA双链结合时，发出荧光;从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量k。 SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是:

1、开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。

2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。

3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。

4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。

如何做选择：

SYBR Green荧光染料能与所有的DNA双链相结合,对DNA模板没有选择性,所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果,对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下,本法是-种成本低廉的选择。

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