贴壁细胞 [35S]标记L-甲硫氨酸（>800 Ci／mmol)／[35S]标记蛋白质水解产物PBS(冷冻) 37℃ 脉冲标记培养基100 mm 组织培养皿 配有液体同位素垃圾阀门的真空吸气器

1. 在 100 mm 组织培养皿中培养细胞到 80%~90% 融合（0.5 × 107~2 × 107 细胞，取决于细胞类型）。

2. 如上所述制备 [35S] 甲硫氨酸的工作液体（见基本方案步骤 1）。

3. 吸弃上清并用 10 ml 预热（37℃）脉冲标记培养基轻柔洗细胞 2 次，弃掉洗液。

4. 加 5 ml 预热脉冲标记培养基，在潮湿、37℃、5% CO2 培养箱内孵育 15 min，以除去细胞内的甲硫氨酸。

5. 弃掉细胞上的培养基，加入 2 ml [35S] 甲硫氨酸的工作液体（见步骤 2），在 CO2 培养箱内孵育 10~30 min。

6. 弃掉细胞上的培养基。用 10 ml 冷冻的 PBS 洗细胞并弃掉 PBS。加 10 ml 冷冻的 PBS，并用塑料刮子或橡胶细胞刮小心刮取收集细胞。

7. 转移悬液到 15 ml 离心管中，4℃，300 g 离心 5 min，弃上清。如果在标记过程中细胞明显脱落，有必要将含有 [35S] 甲硫氨酸的工作液中的细胞小心刮取，并将悬液转移到 15 ml 离心管中，在用 PBS 洗涤前离心。

8. 可选：通过 TCA 沉淀法测定标记掺入的量（见辅助方案）。

如果在标记过程中细胞明显脱落，有必要将含有[35S]甲硫氨酸的工作液中的细胞小心刮取， 并将悬液转移到15 ml离心管中，在用PBS洗涤前离心。

１. 实验材料中贴壁细胞，如 HeLa、NRK、Ml、COS - 1、CV - 1，或原代培养的成纤维细胞或内皮细胞。

２. 如果细胞沉淀不马上使用的话，见基本方案步骤7。

氨基酸代谢标记实验

1. 室温融化 [35S] 标记甲硫氨酸，并用预热的（37℃）脉冲标记培养基制备 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。2. 室温下 300 g 离心 5 min，获得悬液中 0.5 × 107~

备择方案 2 示踪标记细胞

1. 每个时间点和每个样品准备 0.5 × 107 ~2 × 107 细胞， 每 0 .5 × 107 ~2 × 107 细胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脉冲标记

备择方案 3 长期细胞标记

1. 在预热的 37℃ 长期标记培养基中制备 0.02～0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液（见基本方案步骤 1）。2.1 对于悬浮细胞：用预热的长期标记培养基准备并洗细胞一次

以上就是本期的内容，更多资讯，欢迎点击安培生物网站链接了解更多技术与产品资讯。

安培生物科技有限公司介绍：

安培生物坚持为生命科学研究、活体动物转染、大规模生物生产、基因和细胞治疗领域客户，提供独特细胞体内可代谢的核酸转染试剂；inviCELL™Platelet lysate无动物血清产品旨在支持广泛的细胞扩增和生产，包括培养间充质干细胞和多种免疫细胞系等，为制药公司或者生物技术公司提供无血清细胞培养规模生产服务；提供以植物生物为平台基因序列全人源化、独特的细胞培养可分解3D基质胶产品；提供內毒素≦ 1.0 EU/mL、对细胞无毒性影响、高纯度的一型胶原蛋白产品。安培生物专注为生物医药领域提供优质的产品和技术服务，努力发展为基因治疗、细胞治疗的生物科技企业。